YUNANİSTAN’DAN TOPLANMIŞ Brachypodium spp. (POACEAE) POPÜLASYONLARININ FENOTİPİK VE GENETİK KARAKTERİZASYONU

Abstract

Brachypodium distachyon yıllık bir buğdaygil türü olup, son 15 yıldır serin mevsim buğdaygil türleri (tahıllar ve buğdaygil yem bitkileri) için bir model bitki olarak kullanılmaktadır. Ancak Brachypodium’un Arabidopsis gibi başarılı bir model sistem olabilmesi için geniş bir doğal varyasyona sahip genetik kaynak koleksiyonuna sahip olması şarttır. Bu nedenle Brachypodium’un yayılış gösterdiği diğer ülkelerden yeni genetik materyalin toplanması gereği vardır. Yunanistan Brachypodium’un yayılış gösterdiği ülkelerden birisidir. Ancak bugüne kadar Yunanistan’dan Brachypodium genetik materyali sistemli bir şekilde toplanmamıştır. Bu çalışmanın amacı, Yunanistan’dan ilk defa sistemli bir şekilde Brachypodium genetik materyali toplayarak Brachypodium için geniş doğal varyasyona sahip bir genetik materyal kolleksiyonu oluşturma çalışmalarına katkı sağlamak ve toplanan bu aksesyonları karakterize etmektir. Bu amaçla, Yunanistan’ın 60 farklı lokasyonundan, Brachypodium genetik materyali toplanarak bir kolleksiyon oluşturulmuştur. Yürütülen bu çalışmada öncelikle kolleksiyonu oluşturan Brachypodium popülasyonlarının (her popülasyon için 10 tek bitki) ortalama çekirdek DNA içerikleri flow sitometri yöntemi ile belirlenmiştir. Yapılan çekirdek DNA analizleri sonucu kolleksiyonu oluşturan popülasyonlar bariz şekilde görülebilen üç gruba ayrılmış ve her grubun farklı bir Brachypodium türüne ait bireylerden oluştuğu başarılı bir şekilde saptanmıştır. Elde edilen bu sonuçlara göre toplanan 60 popülasyondan 27 tanesinin B. distachyon, 23 tanesinin B. hybridum, 1 tanesinin B. stacei ve 9 tanesinin ise simpatrik (karışık) popülasyon olduğu belirlenmiştir. Çalışmada B. stacei,B. distachyon ve B. hibridium türlerinin ortalama çekirdek DNA içerikleri sırasıyla 0.616, 0.676 ve 1.285 pg/2C olarak belirlenmiştir. Çekirdek DNA analizlerinde standart olarak 0.90 pg/2C DNA içeriğine sahip çeltik (Osmancık 97) çeşidi, florasan boya olarak da propidium iodide kullanılmıştır. Çalışmanın ikinci bölümünde aynı aksesyonlar morfolojik ve fenotipik olarak karakterize edilmiştir. Elde edilen sonuçlar kullanılarak yapılan PCA (Pricipal Component Analysis) ve filogenetik analizlerde üç tür açık bir şekilde ayırt edilmiştir. Yapılan bu istatistiksel analizler sonucunda ayrıca her türün bazı popülasyon ve bireylerinin geniş bir varyasyona sahip olduğu belirlenmiştir. Çalışmanın üçüncü bölümünde üç türü temsilen toplam 192 bireyinin genetik karakterizasyonu, 43 mikrosatellit markör markörü kullanılarak analiz edilmiş ve koleksiyonu oluşturan türlerin sahip olduğu varyasyonun yanı sıra türlerin birbirlerine olan uzaklıkları incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, B. distachyon’un kendine döllenen (f= 0.988) ile B. hybridum’un allotetraploid bir tür olduğunu doğrulamaktadır. Üç tür ikili olarak karşılaştırıldığında genetik farklılaşma: B. distachyon-B. hybridum için Fst= 0.203; B. hybridum- B. stacei için Fst= 0.250 ve B. distachyon-B. stacei için Fst=0.302 değerlerinde olmuştur. Mantel testiyle gerçekleştirilen coğrafik ve genetik uzaklık matrisleri arasındaki karşılaştırma, istatistiksel olarak pozitif orta seviyede bir korelasyon (Rxy=0.432, p=0.001) olduğunu ortaya koymuştur. Genetik ve fenotipik uzaklık matrisleri arasında Mantel testiyle yapılan kıyaslama da, istatistiksel olarak pozitif orta seviyede bir korelasyon (Rxy=0.448, p=0.001) olduğu göstermiştir. Filogenetik analiz ve Bayes modeli kümeleme sonuçları, PCoA ile genotipik karakterizasyon sonucunda ortaya çıkan desenle hemen hemen aynı olmuştur. Üç türün doğal popülasyon yapısını göz önüne alarak gerçekleştirilen tüm analizlerin özetleri şöyledir: B. distachyon türünde üç farklı grup bulunmaktadır. İlk grup kontrol aksesyonlarından (Bd21, Bd21-3, HU1.6 ve Koz-3) oluşmaktadır. İkinci grup, Yunanistan’dan Kilk-1, Kilk-4, Kilk-6, Kilk-7, Edes-2, Edes-5, Edes-7 ve Linos-4 bireylerinden; üçüncü grup da geriye kalan tüm bireylerden oluşmaktadır. B. hybridum türünde ise, Fira ve Pros popülasyonları, popülasyon içi ve popülasyonlar arasında yaygın bir çeşitlilik göstererek, diğerlerinde oldukça farklı genetik ve fenotipik karakteristikler göstermişlerdir. B. stacei türünde, Amfi-1 bireyi Yunanistan’dan toplanan diğer bireylerden ayrılarak, İspanya orijinli AL1.1 ve AL5.2 bireylerinin çok yakınında yer almıştır. B. stacei doğada çok yaygın bir şekilde bulunan bir tür olmayıp, günümüzde gen bankalarında az sayıdı aksesyon ve popülasyonu mevcuttur. Bu çalışmayla ilk kez dördü Yunanistan’dan toplanan yedi farklı B. stacei popülasyonun sahip oldukları genetik ve fenotipik çeşitlilik ile birlikte, yakın akrabası B. distachyon ve B. hybridum türleri ile ilişkisi incelenmiştir.

Brachypodium distachyon is an annual grass which the last 15 years is used as a model plant for the temperate cereals and forage grasses. The research community needs many and highly divergent natural populations of B. distachyon to utilize in the experimental projects. In this study we established the first collection from Greece of B. distachyon and its close relatives, B. hybridum and B. stacei, and we explored the genetic and phenotypic diversity of these species. For this reason, 60 locations were sampled from different places in Greece and 27 B. distachyon, 23 B. hybridum, 1 B. stacei and 9 sympatric populations were collected. Flow cytometry with PI method was used for nuclear DNA content determination and via this method successfully were distinguished the B. distachyon from the B. stacei species (0.676 and 0.616 pg/2C respectively). Phenotypic characterization of the collection was conducted by evaluating 15 morpho-anatomical and physiological characteristics of 603 individuals for three species. The PCA and the phylogenetic analyses clearly discriminate the three species and revealed that there is high phenotypic variation particularly in the some populations and individuals of each species. The genetic characterization of 192 individuals of the three species explored with 43 microsatellite markers. The results testify the inbreeding nature of B. distachyon (f= 0.988) and the allotetraploidy of B. hybridum. The pairwise genetic differentiation of the three pairs is: for B. distachyon-B. hybridum Fst= 0.203, for B. hybridum- B. stacei Fst= 0.250 and for B. distachyon-B. stacei Fst=0.302. The comparisonbetween geographic and genetic distance matrices via Mantel test revealed that there is statistically significant positive moderate correlation (Rxy=0.432, p=0.001). Also, the comparison of genetic and phenotypic distance matrices with Mantel test resulted a statistically significant positive moderate correlation (Rxy=0.448, p=0.001). The outcome of phylogenetic analysis and the Bayesian modeling clustering had almost the same pattern as had been resulted from the PCoA and phenotypic characterization. The summary of all conducted analyses regarding to the natural populations structure for the three species is: In B. distachyon species there are three distinct groups. First group with the control accessions (Bd21, Bd21-3, HU1.6 and Koz-3). Second group with Kilk-1, Kilk-4, Kilk-6, Kilk-7, Edes-2, Edes-5, Edes-7 and Linos-4 individuals from Greece and the third group with all the rest individuals. In B. hybridum species there is spread diversity among populations and individuals with two populations (Fira and Pros) to present very divergent genetic and phenotypic characteristics from all the others. In B. stacei species the Amfi-1 individual diverged from the rest collected from Greece and is more near to the AL1.1 and AL5.2 from Spain. This species is not widespread and only few accessions and populations are available over the world. For first time, we present the genetic and phenotypic diversity of 7 different populations (4 of them collected from Greece), and the relatedness with the close relative species B. distachyon and B. hybridum.