Hayvan hastalıklarının hızlı tespiti için PCR tabanlı moleküler tanı kiti geliştirilmesi: model çalışma

Abstract

Bacillus anthracis özellikle otçul hayvanları etkileyen ancak tüm memelilerde etkili olan şarbon hastalığı etmenidir. B. anthracis’in patojenik özelliği pXO1ve pXO2 olmak üzere iki plazmid üzerinde taşınan virülans genlerine dayanmaktadır. pXO1 antraks toksin genlerini üzerinde taşırken pXO2 plazmidi ise bakterinin dış yüzeyinde bulunan ve konak canlının immün sisteminden kaçmasını sağlayan bir kapsül sentezinden sorumlu gen operonunu taşımaktadır. B. anthracis, B. cereus grubu içerisinde yer alan ve çok yüksek monomorfik özellik gösteren bir türdür. Bugüne kadar geliştirilmiş birçok B. anthracis polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) temelli tanı kiti, virülans plazmidleri üzerindeki markör genlerinin tespitine dayanmakta, B anthracis’in B. cereus grubu içerisindeki diğer türlere kromozomal DNA düzeyinde yüksek benzerlik göstermesi sebebiyle çok azı kit içerisine kromozomal DNA markörlerini dâhil etmektedir. Ancak son yıllarda B. anthracis pXO1 plazmidini taşıyan B. cereus suşları keşfedilmiş ve hem pXO1 hem de pXO2 plazmidlerini taşıyan B. cereus suşları Afrika’da büyük insansı maymunlardan izole edilmiştir. Ayrıca pXO2 kapsül genlerini taşıyan B. thuringiensis suşları da mevcuttur. Bu yüzden pXO1 ve pXO2’nin varlığı B. anthracis’i diğer basil türlerinden ayırmakta yetersiz kalmaktadır. Bu çalışmada, pXO1 ve pXO2 plazmidleri üzerinde yer alan virülans genlerinin yanı sıra, B. anthracis’e özgü kromozomal lambdoid profaj bölgesi de hedeflenerek iki farklı multipleks gerçek zamanlı PCR kiti geliştirilmiştir. Bu kitlerden biri tamamen bu çalışmaya özgün olup, saf DNA örneklerinin yanı sıra sahadan elde edilen örneklerde de başarılı bir şekilde kullanılabilecek, yüksek hassasiyete sahip çift aşamalı bağlanma özelliğinde bir prob ile kromozomal bölgenin tespiti sağlanmaktadır. İkinci kit ise literatürde var olan primer ve prob setlerinin bu çalışmaya adapte edilmesiyle oluşturulmuş, alternatif olarak kullanılabilecek bir tanı kitidir. Ayrıca her iki kit için de yanlış negatif sonuçların değerlendirmesinin yapılabilmesi için internal kontrol fragmentleri tasarlanmıştır. Bu çalışma ile iki kitin de optimizasyonu yapılmış ve başarılı bir şekilde dörtlü multipleks düzende çalışabilirliği gösterilmiştir. Aynı zamanda B. anthracis’e genetik olarak çok yakın basil türlerinden oluşan bir panel kullanılarak kitlerin özgüllüğü test edilmiştir.

B. anthracis is the causative agent of anthrax, which is primarily affecting herbivores but can be seen in all mammalians. Pathogenicity of B. anthracis is based on the virulence genes carried on two plasmids, namely pXO1 and pXO2. While pXO1contains anthrax toxin genes, pXO2 plasmid carries the gene operon responsible for the synthesis of a capsule which enables the bacteria to evade the immune system of the host organism. B. anthracis is a member of the B. cereus group and shows a highly monomorphic lineage. Many B. anthracis polymerase chain reaction (PCR) based diagnosis kits developed up to now rely on the detection of marker genes carried on the virulence plasmids, relatively few assays incorporate chromosomal DNA markers due to high similarity of the B. anthracis to other B. cereus group members at the chromosomal DNA level. However, in recent years, B cereus strains that carry pXO1 plasmid were discovered and strains with both pXO1 and pXO2 have been isolated from African great apes. Besides there are B. thuringiensis strains harboring pXO2 capsule genes. Therefore, presence of pXO1 and pXO2 is insufficient in discriminating B. anthracis from other Bacilli. In this study, two different multiplex PCR kits targeting B. anthracis- specific chromosomal lambdoid prophage region besides the virulence genes on the pXO1 and pXO2 plasmids were developed. One of these kits is completely specific to this study and provides the detection of the chromosomal region with a dual-stage binding probe, which can be used for the environmental samples as successfully as pure DNA samples. As for the second kit, it is a diagnosis kit that can be used alternatively and formed by adapting primer and probe sets existing in the literature. Furthermore, internal control fragments were designed in order to evaluate false-negative results. With this study, optimization of the two kits presented here was performed and their ability to work successfully in a quadruple multiplex setting was shown. At the same time, exclusivity of the kits were tested by using a panel of Bacillus species genetically very close to B. anthracis.