Çiftlik hayvanlarına ait fibroblast, kıkırdak, granüloza ve kas hücrelerinde immunohistokimyasal karakterizasyon ve hücre siklus analizleri

Abstract

Nükleer transfer (NT) sonucu bir canlının klonlanması, yani genetik kopyasının oluşturulması modern biyoteknolojinin günümüzdeki en ileri noktası ve yardımcı üreme tekniklerinin en gelişmişidir. Bu teknoloji üstün genetik yapıya sahip veya hastalıklara dirençli bireylerin sayısını artırmak için kullanılabileceği gibi, aynı zamanda sayıları gittikçe azalan lokal ırkların yok olma sınırından kurtarılması için de kullanılabilecektir. Ancak ilk klonun üretilmesinden bu yana birçok çalışma yapılarak teknoloji iyileştirilmeye çalışılmış olsa da, başarı yüzdesi halen istenilen seviyede değildir. Klon embriyosu ölümlerinin vücut hücrelerinin yetersiz yeniden programlanmasının sonucu olan dengesiz gen ekspresyonları sebebiyle meydana geldiği yaygın bir kanıdır. Donör nükleusun yeniden programlanmasında gerçekleşen bazı hataların klonlamadaki başarısızlıkların temel sebebi olduğu ileri sürülmektedir. Hücre programlanmasının ve dolayısıyla klonlama başarısının anahtar faktörlerinden biri donör hücre ile oositin arasındaki uyumdur. Bu nedenle NT’de en önemli basamak klonlanması istenen canlının hücresinin istenilen siklus dönemine getirilmesidir. Yapılan bu çalışmanın amacı, farklı türlere ait (sığır, koyun, keçi, manda) çiftlik hayvanlarından elde edilen farklı tipteki hücrelerin (deri fibroblastı, kas hücresi, kıkırdak hücresi, granüloza hücresi) immünohistokimyasal karakterizasyonunun yapılmasının ardından, değişik yöntemler kullanılarak (serum açlığı, kontak inhibisyon ve roskovitin) hücre siklusunun istenilen dönemine getirilmesini sağlamak (senkronizasyon), yöntemlerin hücre üzerinde meydana getirebileceği muhtemel zararlı etkileri belirlemek, en iyi sonuç veren ve en zararsız yöntemi tespit etmektir. Yapılan bu çalışmada immünohistokimyasal boyama yöntemi kullanılarak hücrelerin karakterizasyonu yapılmıştır. Senkronizasyon deneyleri sonucunda flow sitometre ile hücrelerin canlılık ve hücre siklusu analizleri yapılmıştır. Bu çalışma sonucunda, dört hayvan türünde klonlama çalışmalarında en az bir kez kullanılmış ve canlı doğum ile sonuçlanmış dört farklı hücre tipi için en yüksek G1/G0 oranı veren ve hücrelere en az zararlı olan bir veya birkaç hücre senkronizasyon seçeneği belirlenmiştir. Bu çalışma şimdiye kadar bu kadar farklı hücre tipinde farklı senkronizasyon yöntemlerinin denendiği ve aynı zamanda bu yöntemlerin hücre üzerindeki zararının analiz edildiği ilk çalışmadır. Ayrıca genetik kaynakların koruma programları kapsamına alınan dondurulmuş hücre bankalarında saklanacak hücreler de düşünülerek tüm uygulamalar hem taze hem de donmuş hücre kültürlerinde karşılaştırmalı olarak yapılmıştır. Sonuç olarak roskovitin uygulanan deney gruplarında senkronizasyon işleminde başarı elde edilememişken, konfluensi ve serum açlığı uygulanan gruplarda senkronizasyon sağlanmıştır. Senkronizasyonun en iyi gerçekleştiği ve hücre canlılığının en az etkilendiği grup ise serum açlığının uygulandığı deney grupları olmuştur.

Cloning of organisms with nuclear transfer (NT), namely production of genetic copy of organisms, is the most advanced point of today’s modern biotechnology and assisted reproductive techniques. This technology can be used to increase the number of genetically superior organisms or disease-resistant individuals as well as to save local breeds the number of which are dwindling from the border of extinction. Although this technılogy could be improved by performing many studies since the production of the first clone, success rate is still not at the desired level. The common belief for deaths of cloned embryo is the inadequate reprogramming of somatic cells which causes unbalanced gene expression. Some failures that occur during reprogramming of the donor nucleus are considered as the main reason for unsuccessful cloning. The one of the key factors for cell programming, and thus success of cloning, is harmony between the donor cell and the oocyte. Therefore, the most important step of NT is to synchronize the cells of desired animal at desired cell cycle stage for cloning. The aim of this study is to characterize of cells (such as skin fibroblasts, muscle cells, cartilage cells and granüloza cells) with immunohistochemistical staining and then synchronize different types of the cells obtained from various species at a particular cell cycle stage using a variety of methods (serum starvation, contact inhibition and roscovitin), to determine the potential harmful effects of methods on these cells, and to establish the less hazardous and the best method. Cells were characterizated immünohistochemistrically. After synchronization experiments, cells were analysed by flow cytometry for cell viability, apoptosis, necrosis and cell cycle stages. As a result of this study, one or a few cell synchronization options giving highest rate of G1/G0 and having lowest harmful effect on cells were identified for four different cell types used at least on time for nuclear transfer studies and resulted in live birth. This is the first study in which several synchronization methods were tested on different cell types and harmful effects of those methods on the cell were analyzed. In addition, taking into account of cells stored in frozen cell banks in the scope of genetic resouces conservation program, all methods were comparatively applied on both fresh and frozen cells. As a result, synchronization wasn’t achieved in roscovitine treated groups, but the cells were synchronized in serum starvation and confluency groups. The groups of best synchronization and the least affected cell viability were serum starvation groups.