Sığır ve koyundan elde edilen farklı tip hücrelerin dondurulmasında kriyo koruyucuların ve ısı değişikliklerinin hücre canlılığı üzerine etkilerinin incelenmesi

Abstract

Hücrelerin biyobankalarda dondurularak saklanması bilimsel araştırmalar sırasında geriye dönebilme veya kaybolan türleri bu hücreleri klonlamada kullanarak geriye getirebilme olanağı sunar. Ancak dondurma işlemi hücreler için öldürücü olabilir ve bu yüzden donma ve çözünme sırasında hücrelerin herhangi bir zarara uğramaması amacı ile dondurma solüsyonu içerisine kriyoprotektan adı verilen çeşitli kimyasal maddeler eklenmektedir. Bunun yanı sıra dondurma hızı da çözüm sonrası hücre canlılığını etkileyen bir diğer faktördür. Sunulan bu tez çalışmasının amacı; kriyo koruyucuların ve ısı değişikliklerinin hücre canlılığına etkisinin araştırılması, hücrelerin zarar görmeden saklanabilmesi ve bu süreç boyunca canlılıklarının en üst seviyede korunabilmesi için onlara zarar vermeyecek koşulların hücre tipi bazında belirlenmesidir. Çalışmada koyun ve sığırdan primer kültür ile elde edilen farklı iki tip hücre hattı ile çalışılmıştır. Bu hücreler koyun ve sığır kulağından elde edilen kıkırdak hücreleri ve ovaryumlarından elde edilen granuloza hücreleridir. Yavaş dondurma tekniği, kriyoprotektan olarak seçilen DMSO ve Gliserolün farklı dozları (%5-10) denenmiştir. Dondurma sırasında kullanılan kriyoproteklanların farklı dozlarının, dondurma tüplerinin içinde bulunduğu malzemelerin (Mr. Frosty, karton kutu, köpük kutu), saklama süresi içinde meydana gelen ısı değişikliklerinin hücreler canlılığı ve proliferasyonu üzerindeki etkileri akış sitometrisi ve MTT analizleri ile değerlendirilmiştir. Sonuç olarak, DMSO uygulanan tüm deney gruplarında canlılık oranı gliserol uygulanan deney gruplarına göre daha yüksek bulunmuştur. Karton veya köpük kutu içinde DMSO kullanılarak dondurulan hücrelerin canlılık oranlarının da benzer şekilde gliserol kullanılarak dondurulanlara göre daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca saklama sırasında meydana gelen ısı değişikliği durumunda da canlılık oranlarının DMSO kullanılan gruplarda gliserole göre daha yüksek olduğu görülmüştür. Bununla birlikte akış sitometrisinde hücre canlılıkları düşük bulunan gliserol gruplarının 24 saat kültürü sonrasında MTT sonuçlarına bakıldığında bazı deney gruplarında proliferasyonun artmış olduğu gözlemlenmiştir. Tüm veriler ışığında çalışmada incelenen tüm koşullarda DMSO’nun hücreleri dondurmanın olumsuz etkisinden gliserole oranla daha iyi koruduğu sonucuna varılmıştır. Mr. Frosty, Köpük ve Kutu içerisinde dondurulan hücrelerde canlılık oranlarında çok büyük farklılıklar görülmemiş, hücre canlılığı üzerinde kritik faktörün kullanılan kriyoprotektan ve konsantrasyonu olduğu sonucuna varılmıştır

Storage of biodegradable cells in a frozen way in biobanks gives opportunities to reversibility during scientific researches or bring the missing species back by using these cells in cloning. However, freezing process can be fatal for cells therefore, during the freezing and dissolution, it is added various chemicals which is named “cryoprotectants” to the freezing solution to avoid damage against cells. In addition, freezing speed is another factor which affects the cell viability after the solution. The purpose of this thesis is the investigation of the effects of cryoprotectants and temperature changes on cell viability, storage of cells without damage and the determination (in a base of cell type) of harmless conditions to protect their viabilities in highest level during process. In this process, it was worked with two different cell lines which is obtained with primer culture from cattle and sheep. These cells are the cartilage cells from cattle and sheep’s’ ear and the granulosa cells that are obtained from its ovaries. Slow freezing technique, the different dose of DMSO and glycerol (%5-10) which is chosen as cryoprotectant is tried. Different doses of cryoprotectants used during freezing, the materials in which the ice cream tubes are (Mr. Frosty, Cardboard Box, Foam Box), effects of heat changes occurring during storage on cell viability and proliferation are evaluated with low cytometry and MTT analysis. As a result, the vitality ratio applied DMSO in experimental groups is found higher than the groups that is applied glycerol. It is detected that the vitality ratio of the cells which is frozen by applying DMSO in carton or foam in box is higher which is similar to cells that frozen by the applying glycerol. It is also seen that the vitality ratio during heat change in storage time is higher as well in the groups that are applied DMSO than the groups that are used glycerol. For all that, the glycerol groups which found their cell vitality low in flow cytometry is observed that after the 24hours culturing, according to the MTT results the proliferation is higher in some experimental groups. In the light of all data, in all conditions that are examined, it is concluded that the DMSO protects the cells better from the negative effects of freezing than the glycerol. It is not seen significant differences in the viability of the cells frozen in the box, Mr. Frosty, and foam. It is concluded that the critical factor is using cryoprotectant and it’s concentration on cell viability