Klon sığır ve jenerasyonlarında mtDNA heteroplazmi ve haplotip analizi

Abstract

Bugünkü anlamıyla klonlama; klonlanmak istenen bireyin vücut hücresine ait çekirdeğin daha önce çekirdeği çıkartılmış olan yumurta hücresi içinde geriye programlanarak bireyin genetik kopyasının oluşturulması anlamına gelmektedir. Üretilen klonların ve onların yavrularının daha ayrıntılı tanımlanması başarı yüzdesi halen istenilen seviyede olmayan teknolojinin daha anlaşılır ve kontrol edilebilir hale gelmesinde faydalı olacaktır. Bu çalışmanın amacı geriye programlama prosesinde ve daha sonrasında gelişim, performans, verim özellikleri gibi değişik parametrelere etkili olabileceği düşünülen alıcı ve verici hücre arasındaki mtDNA farkının ve bireylerdeki heteroplazminin etkisinin daha iyi anlaşılması amacıyla mtDNA varlığının klonlar ve onların yavrularında izlenmesidir. Bu amaçla çalışmada 5 klon boz sığır (1 erkek, 4 di?i), onların 8 adet (F1 jenerasyonu) yavrusu ve bu yavruların 3 adet (F2 jenerasyonu) yavrusunda D-loop?u da içeren mtDNA gen bölgesi PCR ile çoğaltılmış, enzim kesimi ile haplotip farkı, tek iplikli konformasyon polimorfizmi analizi (Single Strand Conformation Polymorphism-SSCP) ve sekans analizi ile mtDNA heteroplazmisi varlığı belirlenmeye çalışılmıştır. Bu analizler sonucunda bir erkek ve iki di?i klonun ve onların yavrularının kan örneklerinde verici hücreye ait mtDNA varlığı saptanmazken diğer iki di?i klonda heteroplazmi tespit edilmiştir. Ancak kan örneklerinde heteroplazmi tespit edilen bu klon dişilerin doku örneklerinde ve bu klonların yavrularının kan örneklerinde heteroplazmi görülmemiştir. Bu sonuç klonlara hücre kaynaklı mtDNA geçişinin ya hiç olmadığını veya tespit edilemeyecek düzeyde olduğunu ve olsa bile bunun hayvanların, sağlığı, gelişimi ve üremesi üzerinde olumsuz etkisinin dikkate değer olmadığını göstermiştir. Haplotip analizi sonuçları ise klonların bazılarının hücre vericisi ile aynı bazılarının farklı haplotipte olduğunu dolayısı ile haplotip farkının da teknolojinin başarısı için dikkate değer olmadığını göstermiştir.

Cloning for today means creating a genetic copy of an individual of which a donor nucleus from a somatic cell of the invidual is taken and reprogrammed into an enucleated oocyte. The identification of the clones and their offspring in details will be useful for understanding and controlling the technology which is not at the desired success level. The aim of this study is to monitor the presence of mtDNA in clones and their offspring in order to understand the difference in mtDNA between recipient and donor cells and the effect of heteroplasmy in individuals, which is thought to be effective for various parameters such as development, performance, yield characteristics in the objective backward programming process and later. For this purpose, mtDNA gene region including D-Loop were amplified by PCR in 5 clone bovine (1 male, 4 female), 8 offspring (F1 generation) and 3 offspring (F2 generation) and the presence of mtDNA heteroplasmy by single strand conformation polymorphism (SSCP) method and haplotype difference by RFLP analysis were determined. The results showed that there is no evidence of donor mtDNA existence in the blood samples of one male and two female clones and their offspring, on the other hand the heteroplasmy is detected in the other two female clones. But heteroplasmy is not observed in the blood samples of the offspring of these female clones that heteroplasmy is detected in the tissue samples of same female clones. The results indicate that either there is no cell mediated mtDNA transition to the clones or it may be very low so that it cannot be detected and even if there is any transition there is no remarkable negative effect on the health, development and reproduction of the animals. The results of the haplotype analysis showed that some of the clones are the same as the cell donor, some are in different haplotypes, and therefore the haplotype difference is not remarkable for the success of the technology.