Flow Sitometri Cross Match Yöntemiyle Sitotoksik Etkinin Değerlendirilmesi

Abstract

Organ nakli günümüzde kronik organ yetmezliği olan hastalar için önemli bir tedavi seçeneğidir. Organ naklinde cross match testi, alıcıda vericinin HLA’ larına karşı mevcut olan antikorların gösterilmesi açısından önemlidir. Komplemana bağımlı lenfositotoksisite (CDC-XM) ve akım sitometrik cross match (FC-XM) şeklinde iki farklı deney olarak yapılmaktadır. Bu iki deney temelde farklı özellikleri test ettiği için alıcı ve verici arasındaki uyumun değerlendirilmesinde her alıcı verici çifti için ayrı ayrı gerçekleştirilir. Son yıllarda CDC-XM ve FC-XM testlerinin yerini alabilecek sitotoksik akım sitometri cross match (cFC-XM) olarak isimlendirilen yeni bir teknik ortaya çıkmıştır. Bu yeni teknik, anti-HLA antikorların lenfositlere bağlanmasını göstermesinin yanı sıra kompleman aracılı sitotoksik hücre ölümünün akım sitometri ortamında tespit edilmesini aynı anda sağlayan, gerekli zaman ve iş yükünü azaltan bir tekniktir. Projemizde ticari olarak sunulan negatif ve pozitif serum örnekleri ile sağlıklı vericiden elde edilen canlı lenfositler arasında CDC-XM, FC-XM ve cFC-XM testleri gerçekleştirildi. Gerekli sarf malzemeler proje bütçesinden alınarak deneysel prosedürler ve gerekli cihaz kullanımları Namık Kemal Üniversitesi, Bilimsel ve Teknolojik Araştırmalar Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde gerçekleştirildi. Projemizde, 7-AAD boyası kullanılarak akım sitometri yöntemiyle kompleman bağımlı hücre ölümü gösterildi. 7-AAD boyası ile akım sitometri ile elde edilen kompleman bağımlı hücre ölümü oranları serolojik yöntemle belirlenen hücre ölümü oranlarına paralellik gösterdi. Bu yöntemle kompleman bağımlı hücre ölümü ve anti-HLA IgG miktarları akım sitometri yöntemiyle ve tek bir deneyle tespit edildi. Ayrıca, pozitif serumun artan dilüsyonlarında hücre ölümündeki azalmaya, FITC-IgG MFI değerindeki azalmanın aynı oranda eşlik etmediği ortaya konuldu. cFC-XM testinin daha fazla örnekte uygulandıktan sonra klinik uygulamalarda kabul görmesini öngörmekteyiz.

Organ transplantation is an important treatment option for patients with chronic organ failure today. Cross match is an important test to show preformed antibodies in the recipient against a specific donor. Cross match test is performed as two different experiments as complement dependent lymphocytotoxicity (CDC-XM) and flow cytometric cross-match (FC-XM). These two experiments separately performed for each donor and receiver pair as they have fundamentally different properties in the evaluation of compatibility. In recent years, a new technique named as cytotoxic flow cytometric cross match (cFC-XM) that can be used instead of CDC-XM and FC-XM has emerged. This new technique, by detecting the complementmediated cytotoxic cell death in addition to capability of showing the anti-HLA antibody binding onto lymphocytes at the same time by flow cytometry, reduces the necessary time and workload. In our project, CDC-XM, FC-XM and cFC-XM tests were performed using commercially available negative and positive serum samples and live lymphocytes obtained from healthy donors. Required supplies have been obtained by project budget and experimental procedures were held at the Research and Application Center for Scientific and Technological Investigations of Namik Kemal University. In our project, complement dependent cell death was detected by flow cytometry using the 7-AAD dye. Complementmediated cell death rates in the cFC-XM by 7-AAD dye were correlated to CDC. With this method, not only complement-mediated cell death but also anti-HLA IgG levels has been detected in a single assay by flow cytometry. Moreover, it was demonstrated by our results that the decrease in cell death at increasing dilutions of a positive serum by cFC-XM was not accompanied by the same rate of decrease in IgG-FITC MFI values. We could conclude that the cFC-XM test would be used in clinical laboratories after validation by more examples.